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从背部看去三叶虫为卵形或椭圆形，成虫的长为3～10厘米，宽为1～3厘米。小型的6毫米以下。三叶虫体外包有一层外壳，坚硬的外壳为背壳及其向腹面延伸的腹部边缘。腹面的节肢为几丁质，其他部分都被柔软的薄膜所掩盖。一般所采到的三叶虫化石都是背壳。三叶虫背壳的中间部分称为轴部或中轴，左、右两侧称为肋叶或肋部。三叶虫壳面光滑。或有陷孔、瘤包、斑点、放射形线纹、同心圆线纹、短刺等。头部多数被两条背沟纵分为三叶，中间隆起的部分为头鞍及颈环，两侧为颊部，眼位于颊部。颊部为面线所穿过，两面线之间的内侧部分统称为头盖，两侧部分称为活动颊或自由颊。胸部由若干胸节组成，形状不一，成虫2～40节。中间部分为中轴，两侧称为肋部。每个肋节上具肋沟，两肋节间为间肋沟。尾部是由若干体节互相融合而形成的，1～30节以上不等。形状一般半圆形，但变化很大，可分为一中轴和两肋部。肋部分节，有肋沟和间肋沟。肋部可具边缘，边缘上亦常有边缘刺。三叶虫腹面的节肢极少保存为化石，迄今为止全世界已发现节肢化石的只有19个种。

从奥陶纪到泥盆纪末的一些三叶虫（比如裂肋三叶虫目）进化出了非常巧妙的脊椎似的结构。在摩洛哥就发现了这样的化石。此外在俄罗斯西部、美国俄克拉何马州以及加拿大安大略省也有带脊椎结构的化石被发现。这种脊椎结构可能是对于鱼的出现的一种抵抗反应。

在描述不同属的区别时，头部不同部位的存在、大小和形状特别重要。

面部是头鞍（glabella）两边的侧叶。三叶虫蜕皮或者死后其活动颊（librigena）往往会分开，暴露其头盖（cranidium）。

三叶虫的躯体分三个体段（tagmata）：头部由口前的两个体节和口后的四个体节完全融合在一起组成，胸部由可以相互运动的体节组成，尾部由最后几个羽尾扇和完全融合在一起的体节组成。最原始的三叶虫尾部的体节构造相当简单。三叶虫的胸部非常灵活——化石的三叶虫有时会像现今的地鳖一样可以将身体卷在一起来保护自己。

三叶虫除了有一对口前的触角和一对尾须外，其他附肢之间没有区别。每个附肢有六个节。属最原始的双肢型附肢，集成了运动和呼吸两大功能，与其他早期的节肢动物类似。

虽然三叶虫只在背部有盔甲，但是它们的外骨骼还是相当沉重的，它们的外骨骼是由甲壳素为主的蛋白质联合方解石和磷化钙等矿物组成的。不像其他节肢动物那样能够在蜕皮前重新吸收外骨骼中的大部分矿物，三叶虫在蜕皮是将所有盔甲中的矿物全部抛弃，因此一只三叶虫可以留下多个良好地矿物化的外骨骼，这提高了三叶虫化石的数量。在蜕皮时外骨骼首先在头部和胸部之间分开，这是为什么许多三叶虫的化石不是缺少头部就是缺少胸部，其实许多化石是三叶虫蜕掉的皮，而不是死去的三叶虫形成的。大多数三叶虫的头部有两个面部缝合来简化蜕皮过程。

许多三叶虫有眼睛，还有可能用来作味觉和嗅觉器官的触角。有些三叶虫是瞎的，可能它们居住在非常深的海底，那里没有光，因此用不着眼睛。有些（比如蛙形镜眼虫Phacopsrana）有很大的眼睛。

三叶虫的眼睛是由方解石（碳酸钙，CaCO3）组成的。纯的方解石是透明的，有些三叶虫使用单晶的、透明的方解石来组成其每只眼睛的透镜。这与大多数其他节肢动物不同，大多数节肢动物使用软透镜的、由甲壳素组成的眼睛。三叶虫坚固的方解石透镜无法像人的软晶状体的眼睛那样来调节焦距。但是有些三叶虫的方解石组成一个内部的、复合结构，这个结构可以降低球差，同时提供极好的景深。在今天生存的动物中蛇尾海星Ophiocomawtii使用类似的透镜。

典型的三叶虫眼睛是复眼，每个透镜都是一个拉长的棱镜。每只复眼内的透镜数不等，有些只有一个，有些可达上千。在这样的复眼中其透镜一般排列为六边形。三叶虫的眼睛可分为全膜眼、裂膜眼和底膜眼三种。

大多数三叶虫具有全膜眼，一些镜眼虫目三叶虫具有更加复杂的裂膜眼，底膜眼只出现在少数较原始的球接子目。

从卵中孵化出来的幼虫被称为原甲期（protaspid），在这个阶段里所有体节全部融合在一起形成一个单一的盔甲。在此后的中甲期（Meraspid）里在每次蜕皮时在尾部前会增加新的胸部体节。在后甲期（Holaspid）蜕皮时体节的数目不再增加。对于三叶虫的幼虫阶段的认识，它们为研究三叶虫之间的亲缘关系提供了非常重要的帮助。

从奥陶纪到泥盆纪末，一些三叶虫（比如裂肋三叶虫目）演化出了巧妙的棘刺（spines）结构，尤其在摩洛哥发现了这样的化石。不过要当心的是许多从摩洛哥出售的带有棘刺结构的三叶虫化石实际上是伪造品。此外在俄罗斯西部、美国俄克拉何马州以及加拿大安大略省也有带棘刺结构的化石被发现。这种棘刺结构可能是对于有颌鱼类的出现的一种抵抗反应。

据《新科学家》（2005年5月）的报道“有些……三叶虫……的头上有类似现代甲虫的角。”根据这些角的形状、大小和位置伦敦大学玛利皇后学院的罗布·克奈尔（RobKnell）和伦敦自然历史博物馆的理查德·福提得出结论认为它们用来作为寻找配偶时进行角斗。假如这个理论正确的话，三叶虫是进化史上最早表现这个行为的动物。

三叶虫的大小在1毫米至90厘米之间，典型的大小在2至7厘米间。最大的三叶虫是2009年在葡萄牙阿洛卡地质公园里奥陶纪的岩石里被发现的。

三叶虫与珊瑚、海百合、腕足动物、头足动物等动物共生。大多适应于浅海底栖爬行或以半游泳生活，还有一些在远洋中游泳或远洋中漂浮生活。生活习性的不同决定着其身体构造不同。底栖三叶虫身体扁平，有的三叶虫可钻入泥沙生活，其头部结构坚硬，前缘形似扁铲，便于挖掘。有的头甲愈合，肋刺发育，尾小，具尖末刺，用以在泥沙中推进。另外，适于在松软或淤泥海底爬行生活的类型，其肋刺和尾刺均很发达，使身体不易陷入泥中。营漂浮生活的类型，往往身体长满纤细的长刺。它们以原生动物、海绵动物、腔肠动物、腕足动物的动物尸体或以海藻等细小生物为食。

三叶虫的生活习性是多种多样的，化石中最多的一类是保存在石灰岩或页岩中，可见当时它们大多生活在浅海底或游移于淤泥之上。它们有的稍能游泳，有的随水漂流。志留纪中期的齿虫类，整个身体几乎被密密的长刺包围，这些长刺对于它们在水里游泳来说是一种强有力的推进器，因此可以推测它们是游泳的能手；同时，这些长刺也是抵御天敌的有效武器。这种类型的三叶虫主要是出现于奥陶纪到泥盆纪时期，当时与它共生的鹦鹉螺类、板足鲎类和鱼类都是三叶虫的劲敌，如果三叶虫不增强它的游泳能力和御敌的武器，它们怎样在那个竞争激烈的环境中继续生存繁衍呢？

奥陶纪的某些三叶虫，如宝石虫、斜视虫、隐头虫等还发展了卷曲的能力，它们的头部和尾部可以完全紧接在一起，仅将背部的硬壳暴露在外；它们还可以钻进淤泥以保护其柔软的腹部器官，这样，一方面便于御敌；另一方面也可以以类似于尺蠖那样的伸曲的方式推动身体前进。

三叶虫为雌雄异体，卵生，个体发育过程中经过多次周期性蜕壳，在个体发育过程中，形态变化很大。一般划分为3个阶段：幼虫期、分节期、成虫期。对于三叶虫的个体发育过程，科学家通常是通过采集同一层位中同一种个体的不同生长阶段的标本来研究的。三叶虫的个体发育，大致划分为三个时期——幼年期、中年期和成年期。幼年期虫体头部和尾部尚不分明，也没有胸节，直径大约为0.24～1.3毫米。中年期虫体头部和尾部已经分开，胸节也已经发育，但是节数比成年期少一节。成年期虫体的胸部与尾部节数增加到了极限，虫体增大，壳上的刺、瘤等附加物均出现了。

经过各国古生物学家多年的研究，认为三叶虫具有复杂的发育阶段。三叶虫为雌雄异体，卵生，在它们在一生的发育中，要经过多次的蜕壳才能长成，当前的许多节肢动物都承袭了三叶虫的生长方式。三叶虫从幼虫到成虫，一般经历三个生长阶段，即幼年期、分节期和成虫期。了解这点，对我们在野外采集三叶虫化石很有必要，如果人们稍微具备一些有关三叶虫发育阶段的知识，就能对采集到的三叶虫化石做出大致的鉴定，不致于把不同发育阶段的同一种三叶虫当做不同形态的属种了。

从卵中孵化出来的幼虫被称为原甲期（protaspidperiod），在这个阶段里所有环全部融合在一起形成一个单一的盔甲。在此后的生长期里在每次蜕皮时在尾部前会增加新的胸部环。此后在蜕皮时环的数目不再增加，对三叶虫的幼虫阶段人们的认识很丰富，它们为研究三叶虫之间的亲缘关系提供了非常重要的帮助。

幼年期的三叶虫除身体很小外，常常凸起明显，头部与尾部区分不明显，没有胸节，虫体呈圆球状。以后，随着三叶虫不断生长，胸节逐渐增加，当胸节全部长成不再增加时就进入成年期，此时意味着三叶虫已达到性成熟阶段，能够生儿育女了。三叶虫每蜕一次壳，身体都会增大，壳上的刺、瘤、甚至尾甲的分节数也会增加。

三叶虫长大以后就可以在海洋中无忧无虑地生活了，至今为止，人们还没有在陆相地层中发现三叶虫化石，这说明这种动物确实只生存在海洋里。由于三叶虫化石常常与珊瑚、腕足动物、头足动物共同出现，表明它们都喜欢生活在比较温暖的浅海，在那里，三叶虫以各种微小的生物为食，或者也对海草及动物的尸体感兴趣。可以肯定，它们不具有主动攻击的能力，因为三叶虫没有良好的游泳器官，也不具备流线形的体形，在水中行进的速度较慢。从它们的坚固背甲可以想象，一旦有凶猛的动物（如鹦鹉螺类）向它们摆出进攻的架势时，三叶虫会迅速把身体蜷起，象穿山甲那样把自己保护起来，悄悄沉入海底。